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过氧化氢酶试验 —— 原理、用途、操作步骤及注意事项

发布时间：

2025-07-07

过氧化氢酶试验是一种生化检测方法，用于判断生物体是否产生过氧化氢酶。过氧化氢酶的作用是中和过氧化氢（H₂O₂）的杀菌效应。它能加速H₂O₂分解为水和氧气，该反应可通过快速产生气泡来观察。
👉 过氧化氢酶试验的历史
基于酶的检测方法在细菌鉴定中起着关键作用。1893 年，戈特斯坦（Gottstein）的一篇论文首次关注到细菌过氧化氢酶，使其成为最早被描述的细菌酶之一。
约 30 年后，麦克劳德（McLeod）和戈登（Gordon）开发并发表了被认为是首个基于过氧化氢酶产生及反应的细菌分类体系。
早期检测过氧化氢酶的方法繁琐、劳动强度大、耗时，且需要专用设备。多年来，加尼翁（Gagnon）等人最初描述的技术，尤其是托马斯（Thomas）的方法已被改良和优化，从而极大地简化了该检测的操作。
👉 过氧化氢酶试验的用途
⚫ 检测细菌是否产生过氧化氢酶
⚫ 区分过氧化氢酶阴性的链球菌、肠球菌与阳性的葡萄球菌、微球菌
⚫ 区分耐氧的梭菌属（阴性）与芽孢杆菌属（阳性）
⚫ 可辅助鉴定部分肠杆菌科细菌
⚫ 用于细菌属间鉴别，对某些革兰阳性菌（如气球菌属）的种水平鉴定有价值（尿气球菌Aerococcus urinae，阳性、绿色气球菌Aerococcus viridians，阴性）
👉 过氧化氢酶试验的原理
细菌有氧代谢产生H₂O₂，其积累会破坏细胞成分，达致死浓度时导致细菌死亡。含细胞色素系统的需氧菌和兼性厌氧菌普遍含有过氧化氢酶，该酶为四聚体，由四条约500个氨基酸的多肽链组成，每条链携带一个含铁血卟啉基团，可高效结合 H₂O₂。其催化效率极高，单个分子每秒可分解数百万个 H₂O₂分子为水和氧气，从而消除毒性保护细菌自身免受其致死效应的影响。
严格厌氧菌因缺乏超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶，无法清除有氧环境中的超氧阴离子（O₂⁻）和 H₂O₂，活性氧毒性浓度引发氧化应激级联反应，导致细胞代谢崩溃死亡，这一机制清晰解释了氧气对严格厌氧菌的致死效应。
过氧化氢酶检测方法：将少量待测菌接种于 H₂O₂溶液，有酶时迅速产生氧气气泡，无或微弱气泡则表明酶缺乏。需使用 24 小时内新鲜培养物，需氧菌用 3% H₂O₂，厌氧菌用 15% H₂O₂。

👉 过氧化氢酶试验的操作步骤
1. 试管法
🔘 向试管中倒入 1 - 2ml 的H₂O₂溶液。
🔘 用接菌环挑取 18 - 24 h的待测菌落，将其浸入过氧化氢溶液中。
🔘 在深色背景下观察是否立即产生气泡。
2. 玻片法
🔘 用接种环挑或涂布棒取少量待测菌落，将其转移至干净、干燥的载玻片表面。
🔘 在载玻片上滴加一滴 3% 的过氧化氢溶液，勿混合。
🔘 在深色背景下立即观察是否有氧气气泡产生。
3. 试管（斜面）法
🔘 向营养琼脂斜面上生长的 18~24 h大量纯培养物直接滴加 1.0 ml 3% 过氧化氢溶液
🔘 将试管置于深色背景前，观察是否立即产生气泡
👉 过氧化氢酶试验的结果判读及示例
1. 阳性结果：产生大量气泡，有明显的气泡活动。
🔶 示例：葡萄球菌、微球菌、李斯特菌、白喉棒状杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、诺卡菌、肠杆菌科（柠檬酸杆菌、大肠杆菌、肠杆菌、克雷伯菌、志贺菌、耶尔森菌、变形杆菌、沙门氏菌、沙雷菌）、假单胞菌、结核分枝杆菌、曲霉菌、隐球菌和马红球菌。
2. 阴性结果：没有气泡产生或仅有极少量气泡产生。
🔶 示例：链球菌和肠球菌。
过氧化氢酶试验的质量控制
⚫ 阳性对照：金黄色葡萄球菌
⚫ 阴性对照：粪肠球菌
👉 过氧化氢酶试验的注意事项
1. 切勿从血琼脂培养基中取待测菌。因为红细胞中含有过氧化氢酶，若存在红细胞，会导致假阳性结果。
2. 应使用 18h ~24 h的培养物进行试验，老化菌会因酶活性丧失出现假阴性。
3. 过氧化氢酶活性与需氧代谢相关，厌氧菌培养后需暴露于空气中至少 30 分钟再检测，否则易假阴性
4. 厌氧菌加试剂后，阳性反应可能延迟至 1 分钟。
5. 有些细菌会产生过氧化物酶，该酶也能催化H₂O₂分解，导致反应呈弱阳性（缓慢产生少量气泡）。应将这种情况与真正的阳性反应区分开来。
6. 部分金黄色葡萄球菌菌株用滴加法可能呈阴性，需用试管法重复试验。
7. 颠倒试剂与菌落的添加顺序可能导致假阴性。
8. 使用铁丝和铂接种环，如果接触到H₂O₂，会导致假阳性结果。镍铬丝接种环则无此问题。
9. H₂O₂溶液必须新鲜配制，因为它非常不稳定。
10. 同一实验中若斜面有其他用途，可在使用后添加过氧化氢以节省材料。
11. 始终采用严格的无菌技术，尽可能在生物安全柜内进行试验。
12. 玻片法时将载玻片置于培养皿内，保留培养皿盖备用。滴加3%过氧化氢溶液后立即盖上培养皿盖以减少已证实可携带活细菌细胞的过氧化氢酶气溶胶。
13. 30% H₂O₂有强腐蚀性，避免接触皮肤，若不慎接触，用大量流动清水冲洗。
👉 在 GB 4789中的应用
标准   过氧化氢酶试验结果
GB 4789.9-2014      空肠弯曲菌阳性（+）
  结肠弯曲菌阳性（+）
  海鸥弯曲菌阳性（+）
  乌普萨拉弯曲菌阴性（-）或微弱
GB 4789.11-2014      β-溶血性链球菌阴性（-）
GB 4789.14-2014      蜡样芽孢杆菌阳性（+）
  苏云金芽胞杆菌阳性（+）
  蕈状芽胞杆菌阳性（+）
  巨大芽孢杆菌阳性（+）
GB 4789.30-2025      单核细胞增生李斯特氏菌阳性（+）